天然虫草对小鼠脾脏影响的组织化学和免疫细胞化学的观察

2020-08-16 编辑：藏红花

来源：中国组织化学与细胞化学杂志

作者：葛振华　周凡　黄守雄　王若愚 (福建省中医药研究院)

摘要：本文用30只成年雄性小鼠, 分为实验和对照两组。实验组每日灌服虫草液一次, 共7日。对照组每日灌服生理盐水一次。按时将动物处死,取其脾脏进行组织化学和免疫细胞化学染色。结果显示: ( 1) 虫草组小鼠脾脏白髓成份增加, 生发中心明显, 嗜派罗宁细胞增多。显微分光光度计检测结果显示虫草组脾脏内DNA含量高于对照组, 表明虫草能促进小鼠脾脏RN A和DN A的合成。( 2) 虫草组脾内IgG+ 和IgM+ 浆细胞明显增加, 边缘区变宽, 可能虫草有促进抗体形成的作用。此外本实验还证明, 两组小鼠脾内巨噬细胞数量无明显差别。

为了探讨天然虫草( co rdy ceps sinensis) 对机体免疫功能及其他方面的影响, 实验采用组织化学和免疫细胞化学方法对虫草水剂灌胃后的小鼠脾脏进行了观察, 这方面的工作尚未见报道。

材料与方法：

一、动物: 30只纯系ICR雄性小鼠, 体重为18～ 22g , 购自上海计划生育所。实验组20只, 每日灌服虫草水剂一次, 每次100mg /0. 5ml, 共7日。对照组10只, 每日灌服0. 5ml生理盐水一次, 共7日。7天后将动物处死, 取出脾脏分别固定于Carnoy 氏液, 10%甲醛-醋酸和甲醛-钙固定液。Carnoy氏液和甲醛-醋酸固定的标本, 按常规脱水和石蜡包埋; 甲醛-钙固定的组织, 4℃ 24h 后, 转入蔗糖-明胶溶液, 4℃保存, 用于冰冻切片。切片厚度为5μm。为了观察虫草对巨噬细胞的影响, 两组各取5只小鼠在处死前一小时由尾静脉注入0. 3ml印度墨汁(浓度为16mg /ml ) , 取其脾脏的1 /4固定于4%甲醛, 常规脱水, 包埋, 切片厚5μm。

二、试剂: 生物素标记的羊抗小鼠IgM和IgG抗体以及ABC试剂盒为Vecto r Lab公司。DAB为Aldrich公司, 醋酸萘酚AS-BI磷酸盐为Sigma 公司, 印度墨汁为英国Schmid产品。

三、DN A用Feulgen法染色, 后用中国中医研究院MPV-2型显微分光光度计对两组小鼠脾脏红、白髓细胞DN A进行定量测定, 以后再进行统计学处理。甲绿一派罗宁法显示DN A和RN A。免疫细胞化学按照ABC直接法进行：冰冻切片, 粘在用明胶处理过的玻片上, 丙酮固定5min, 入pH7. 4的PBS 5min后, 入0. 3%H2O2 10min, 流水洗后入PBS 20min, 除去多余液体后加上生物素标记的羊抗鼠的IgG或IgM ( 1∶150) , 室温孵育1. 5h, PBS洗后,加上1∶100的ABC混合液, 室温45min; PBS洗后加上DAB混合液( 3mg DAB+ 10mlPBS+ 40μ13% H2O2 ) , 10～ 15min, 水洗5min, 常规脱水透明, 树胶封片。对照片用正常羊血清代替抗体, 其他步骤同上。非特异性酯酶( AN AE) 和碱性磷酸酶( ALP) 按HSU的方法进行。显示巨噬细胞是用注射墨汁小鼠的脾固定切片, 脱蜡后封片, HE染色作一般形态学观察。

结果

HE染色的切片, 虫草组的白髓面积比对照组增加, 脾小体增大, 生发中心明显。在生发中心处常见分裂相。两组脾DN A定量的检测结果表明, 虫草组红、白髓的DN A含量均高于对照组, 而且有显著性差异。

甲绿派罗宁染色显示, 虫草组脾脏内有较多嗜派罗宁细胞, 如生发中心的淋巴母细胞, 边缘区的B细胞以及脾索内的浆细胞和淋巴细胞等, 胞质内均含有嗜派罗宁颗粒。此外巨核细胞的胞质也被派罗宁染色。上述反应均比对照组明显。

免疫细胞化学染色显示, 虫草组小鼠, 脾内IgG+ 和IgM+ 浆细胞数量均比对照组明显增加, 这些浆细胞往往成团存在于脾索或血窦周围。脾小体细胞对IgG反应较弱, 但虫草组IgG+ B细胞仍多于对照组; 对IgM的反应, 两组差别更为显著。除了红、白髓内虫草组有较多的IgM+ 浆细胞外, 边缘区和脾小体处的IgM+ B细胞也明显增加, 导致虫草组小鼠脾内的边缘区增宽, 脾小体增大, IgM反应增强等变化。

ALP+ 细胞主要是分布在边缘区的B细胞, 生发中心和红髓内很少见到ALP+细胞。此外血管内皮也呈阳性反应。两组小鼠脾边缘区的ALP+ 细胞无明显区别。AN AE+ T细胞主要分布在动脉周围淋巴鞘, 红髓内也有少数AN AE+ 细胞, 呈散在分布。

吞噬墨汁的巨噬细胞, 对照组主要位于脾小体外周的边缘区, 红髓内少见。虫草组红髓和动脉周围淋巴鞘处巨噬细胞增加, 边缘区减少, 但在巨噬细胞的数目两组无明显差别。

讨论

一、虫草对小鼠脾脏RN A和DN A的影响：

有人指出虫草能加速小鼠脾脏核酸和蛋白质的更新, 使RN A含量增加, 蛋白质代谢增强。我们的研究进一步证明, 虫草组脾脏除白髓面积增加外, 一些淋巴细胞和浆细胞内的嗜派罗宁颗粒增多, 同时红髓和白髓内DN A含量也高于对照组; 白髓内DN A含量增加可能与细胞分裂和增殖有关, 红髓内则可能与单位面积内细胞密度(浆细胞和淋巴细胞) 增加有关。

二、虫草对小鼠脾脏免疫反应的影响

过去曾报道过虫草和拟青霉对小鼠体液免疫和细胞免疫均无影响, 甚至对抗体形成细胞有抑制作用。然而我们的实验证明, 虫草组脾内IgG+ 和IgM+ 浆细胞增加, 这些细胞又往往分布在脾索或血窦周围,我们认为这种现象可能有助于分泌的抗体尽快释放到血液循环,产生免疫反应。另一特征是虫草组小鼠脾脏边缘区和脾小体等处IgM+ B细胞增加, 特别是边缘区B细胞增加更具有免疫学意义, 因为该区B细胞是产生抗体的前身细胞, 具有免疫活性。边缘区和脾小体处的B细胞虽然均能与IgM抗体反应, 但与ALP反应不同, 提示两处是不同的B细胞亚群。有意义的是, 虫草组脾脏边缘区IgM+ B细胞增加时, ALP 细胞并无相应的增加, 与对照组相比无明显差别。这说明边缘区IgM+ 细胞内还有部份ALP细胞; 提示ALP并非一切B细胞的共同特征, 只是浆细胞前身细胞的一个标志物, 反映出边缘区B细胞处于不同的分化阶段。

虽有报道说虫草能增强小鼠脾脏的细胞免疫功能, 但从我们的结果看来, AN AE+ T细胞在虫草组未见明显增加, 此外AN AE是非特异的, 这样更增加了结果评估的困难性。

三、虫草对巨噬细胞的影响

过去的研究证明, 虫草不仅能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性, 也能促进脾脏巨噬细胞的增殖。我们的结果不支持后一种结论。我们观察到两组脾内巨噬细胞数量相似; 所不同的是虫草边缘区巨噬细胞减少, 而红髓和动脉周围淋巴鞘处增多。这种现象可能是边缘区部分巨噬细胞将抗原递呈给淋巴细胞,从而导致局部淋巴组织增生。此外我们的实验还证明小鼠脾内的巨噬细胞有功能的异质性, 如吞噬墨汁的巨噬细胞位于边缘区, 不能吞噬墨汁的则位于红髓, 这与Ko tani等的报道相一致。Humphery和Grennan的试验也证明边缘区和红髓内的巨噬细胞存在功能上的异质性, 如边缘区的巨噬细胞选择性地吞噬中性多糖, 而红髓的巨噬细胞则选择性地吞噬酸性多糖。Vliet等用单克隆抗体也证实小鼠脾小体边缘区有一个独特的巨噬细胞亚群, 与其他部位的不同。关于虫草对小鼠脾脏DN A, RN A以及免疫球蛋白合成的影响,可能是非特异免疫刺激的结果, 因为虫草含有多种氨基酸和多糖, 功能是多方面的, 其作用机理有待进一步研究。

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