虫草多糖对皮肤成纤维细胞抗氧化能力的影响

2020-08-16 编辑：藏红花

作者：李华李伯勤应馨萍

来源：上海中医药大学学报

目的：探讨虫草多糖(CP)对皮肤成纤维细胞光老化保护作用中对胶原的影响。方法：用8-甲氧补骨脂素联合UVA(8-MOP/UVA)诱导皮肤成纤维细胞光老化，用电镜观察、羟脯氨酸含量、丙二醛含量测定及免疫细胞化学等方法观察虫草多糖对成纤维细胞光老化过程中胶原的影响。

结果：光老化组细胞较对照组蛋白合成功能不活跃，羟脯氨酸含量下降，丙二醛含量升高，Ⅰ型胶原表达降低，Ⅲ型胶原表达增高，虫草保护组细胞有所改善。

结论：虫草多糖对8-MOP/UVA诱导光老化的皮肤成纤维细胞胶原变化具有逆转作用。

皮肤是机体最大的器官，皮肤老化是机体衰老的重要组成部分，皮肤老化包括两个过程，内在老化(intrinsic或chrondogic aging)和光老化(actinic aging或photoaging)。前者主要受遗传和代谢等因素的影响，可通过改善全身营养代谢平衡等措施加以防护；后者则主要由长期紫外线照射所致，只能通过避免阳光照射和使用防晒药物来预防，而在实际生活中后者是很难避免的。另外，在医学上，皮肤光老化一方面是皮肤科里最常见的一种治疗副作用之一，例如银屑病、白癜风、慢性湿疹、异位性皮炎、严重脂溢性皮炎等疾病，主要的治疗方法是光敏药物合并光照治疗，产生的最主要的副作用就是光老化；另外又是光老化性皮肤病的主要症状，光老化性皮肤病是日晒后发生的多形性光变态反应性皮肤病，是高原地区较为常见的一种光敏性皮肤病。最后，光老化还与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌等的发生也有着病因学的关系，而且有损于美容，因此预防和延缓皮肤光老化已成为生命科学特别是皮肤病学科的研究热点之一。目前对光老化的防护主要是化学制剂涂抹，但长期应用化学制剂均有各种毒副作用。中草药是天然药物，副作用少，容易被人们接受，有人用冬虫夏草来抗皮肤衰老，但其是否有效及其作用机制还未见报道。本实验室在小鼠在体和离体实验中均发现虫草多糖(CP)对UVA/8-MOP诱导的皮肤光老化具有保护作用，并进一步研究虫草多糖对皮肤成纤维细胞中胶原表达变化的影响。

1 材料与方法

1.1 药物和制剂虫草多糖由中草药冬虫夏草提取，纯度大于95％，由上海中医药大学肝病所提供。PRM1640培养基、EDTA-胰酶购自GIBCO公司，胎牛血清购自Hyclone公司，组织羟脯氨酸试剂盒、丙二醛检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原抗体及二抗等相关试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 动物昆明种小白鼠，出生24 h内，用于原代皮肤成纤维细胞培养，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3 方法

1.3.1 原代皮肤成纤维细胞的培养出生24 h内的新生鼠于75％酒精浸泡片刻，取出，置于Hank’S缓冲液，取背部皮肤，依次于Hank’s缓冲液、1640培养液、20％胎牛血清的1640培养液中漂洗，剪碎、植块培养。

1.3.2 光老化模型建立及虫草多糖的保护将培2～3代的皮肤成纤维细胞转入六孔板，细胞长至50％～60％。正常对照组：正常培养液培养；光老化组：加入100 ng/ml 8-MOP预先孵育24 h，予UVA2.7 J/cm2照射(UVA功率为190 μW/ cm2)，造模完成后换正常培养液；虫草保护组：100 ng/ml 8-MOP与虫草多糖共同孵育24 h后，予UVA2.7 J/ cm2照射，虫草多糖浓度为20μg /ml和40μg /m。

1.3.3 超微结构观察细胞造模及保护后24 h，收固定于4％戊二醛磷酸缓冲溶液中，4℃，保存1 h；PBS冲洗；1％锇酸，4℃ ，后固定1 h；PBS冲洗；50％、70％、80％、90％、100％乙醇梯度脱水；100％丙酮浸透15-30 min；包埋剂包埋；分别在37℃ 、45℃、60℃，各24 h聚合；用超薄切片机切成50nm的超薄切片；醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色；透射电镜观察照相。

1.3.4 羟脯氨酸、丙二醛含量检测造模后24 h，受细胞培养液测丙二醛，细胞用胰酶消化收集，PBS洗2遍，各组加400μl三蒸水，反复冻溶3次，3500r/min离心10 min，取上清测羟脯氨酸含量。方法按试剂盒说明书进行，每次检测同时进行总蛋白检测，重复3次。

1.3.5 细胞免疫化学染色细胞造模及保护后4 h，4％戊二醛固定15 min，PBS洗3次，正常非免疫血清，孵育30 min，一抗孵育60 min，PBS洗3次，二抗孵育30 min，显色和复染后拍照。

1.4 统计学方法各组间比较采用t检验统计分析。

2 结果

2.1 对与胶原合成相关细胞器形态改变的影响皮肤成纤维细胞合成的蛋白质主要是胶原，正常对照组：与蛋白质合成功能相关细胞器呈功能旺盛状态，光老化组细胞器功能呈不活跃状态，虫草多糖保护组明显改善。细胞超微结构改变如下：对照组细胞边界清晰，核呈不规则形态，边界清晰，核质均一，核仁均质，胞质内细胞器较多，线粒体成颗粒状或短杆状，形态清晰，线粒体嵴清晰可见，粗面内质网多，多数成管网状，内质网腔内有着色的均质颗粒，为蛋白质，提示细胞功能旺盛；光老化组细胞边界模糊，核也为不规则形态，但核质不均一，核仁内基质尤其明显，呈边集现象，胞质内线粒体少，粗面内质网少，多成空泡状，内质网腔内无着色颗粒，说明细胞功能不活跃；虫草多糖保护组，20μg /ml组和40 μg/ml组，细胞形态明显改善，细胞核内及核仁内基质变均匀，内质网也多成管网状，内有着色颗粒，线粒体也增多，说明细胞功能有了较好的改善。

2.2对羟脯氨酸含量及丙二醛的影响羟脯氨酸含量检测结果显示，在光老化组，细胞的羟脯氨酸含量较对照组明显下降，而虫草多糖保护组的羟脯氨酸含量明显回升，并且差异有显著性，该指标反应的是细胞胶原蛋白的含量。丙二醛含量检测显示，在光老化组，丙二醛较对照组明显增高，虫草多糖保护组明显降低，该指标反应的细胞氧化程度，老化的细胞氧化程度高，年轻的细胞氧化程度低。

2.3 对细胞胶原种类的影响免疫细胞化学结果显示：I型、Ⅲ型胶原均表达在细胞质中，染成蓝色，在正常对照组细胞中细胞数量较多，I型胶原表达较多；光老化组细胞量减少，细胞质染色较少；在虫草保护组、20μg /m1组，细胞数量较对照组多，胞质染色也较深，而虫草多糖浓度为40μg /ml，胶原的表达也较模型组要多，但较20μg/ml组没有增加。Ⅲ型胶原在正常对照组细胞中，表达较少，细胞质被染成很淡的蓝色，光老化组较对照组胶原表达较多；在虫草保护组，20μg/ml组，细胞数量较对照组多，胞质染色较模型组淡，而虫草多糖浓度为40μg/ml，胶原的表达也较模型组更淡。

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