藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制
藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制
Effect and mechanism of HeLa cell apoptosis induced by crocin
出处：中华肿瘤防治杂志2009年10月第16卷第19期
作者：龚青、石丁波、蔡卫斌、杨中汉、谭维格、廖彩韵、彭超、刘畅、高国全、杨霞（中山大学中山医学院生物化学教研室 广东广州 510080）
目的：研究藏红花素对HeLa细胞的促凋亡作用和机制。
方法：设置0、0.2、0.4及0.8mmol/L 4个浓度梯度，MTT法分析不同浓度藏红花素对HeLa细胞增殖的影响；设置空白阴性对照及秋水仙素（10μg/L）阳性对照，向HeLa细胞培养物分别加入0.4和0.8mmol/L 的藏红花素，培养48h后用PI/Annexin V双染法分析其凋亡情况；1.6mmol/L 藏红花素作用于HeLa细胞72 h后，蛋白质印迹法检测Caspase-3的切割。结果：MTT实验分析显示，在0、0.2、0.4及0.8mmol/L 浓度下HeLa细胞存活率分别为1、0.964、0.796和0.586。藏红花素显著地抑制HeLa细胞生长，P<0.05；各浓度组间均差异有统计学意义，P<0.05。PI/Annexin V双染法、流式细胞仪检测显示，阴性对照组、10μg/L秋水仙素阳性对照组、0.4 及0.8mmol/L藏红花素处理组的细胞凋亡率分别为3.64%、15.99%、4.86%和9.28%，藏红花素促进HeLa细胞凋亡。蛋白质印迹法检测显示，藏红花素促进HeLa 细胞Caspase-3切割。
结论：藏红花素可明显地抑制HeLa细胞生长，并通过增加HeLa细胞Caspase-3切割促进其凋亡。
藏红花（Crocus sativas L.）是鸢尾科番红花属球根类草本植物，自古便是活血化瘀的良药。最新研究发现，藏红花还具有广谱抗癌活性，对白血病、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用，而且毒性较小。藏红花素（crocin）是藏红花最主要的一种色素，对多种癌细胞均有明显抑制作用，且与其他常用抗癌药物配合使用，可降低这些药物的毒副反应，改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明，其有多种可能的作用通路，其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。本研究旨在对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行研究，并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
藏红花素和MTT购自美国Sigma公司，20mg藏红花素加12.5mg EDTA溶于4mL三蒸水，配成浓度为50mmol/L的母液，储存于4℃；RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自Bender Medsystens公司（凯基生物）。Caspase-3抗体购自Sant公司。
1.2 细胞系
HeLa细胞株可连续传代，将细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，长满后0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 主要仪器
包括超净工作台、二氧化碳培养箱和HITACHI分光光度仪。
1.4 MTT法
取对数生长期的HeLa细胞，进行细胞计数，用细胞培养液调整细胞密度为2×104 个/mL 接种到12孔平板，每孔为2 mL，将平板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞贴壁后，吸出上清，加入含藏红花素的无血清培养液2mL，使得HeLa细胞藏红花素的浓度为0、0.2、0.4和0.8mmol/L，待检样品继续培养48 h。在实验终止前4 h加MTT（5 g/L）200μL/孔，继续孵育4h，吸出上清液，每孔加入1mL DMSO，摇匀，待Formazan溶解后，分光光度计在570nm处测OD值。实验中每份样品设3个复孔。用各个浓度的OD吸收值平均值除以对照组的OD吸收值，得出细胞存活曲线。
1.5 PI/Annexin V双染法
将对数生长期的细胞用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度加入6孔培养板中继续培养，当细胞达到60%～70%融合时加入以无血清培养液配制的浓度为0.4和0.8mm/L 的藏红花素，阴性对照组为等量无血清培养液，阳性对照组为秋水仙素（10μg/L）。培养箱中继续培养48h后，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，进行PI/Annexin V双染，流式细胞仪测定凋亡指数，进而分析确定藏红花素对HeLa细胞的凋亡作用。
1.6 蛋白质印迹法
SDS细胞裂解液收集药物处理24h的HeLa细胞，冰上超声1min，煮沸10min，10000r/min（r=10.3cm）离心15min，取上清液，行蛋白定量分析，然后进行SDS-PAGE电泳，再将其转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭1h，加入1:1000 稀释的兔抗人切割Caspase-3抗体，4℃孵育过夜，再加入1:1000稀释的羊抗兔IgG 抗体，室温孵育2h，ECL显色，曝光。
1.7 统计学方法
所有数据用x±s表示，通过SPSS11.0 软件完成。采用方差分析，并用最小有意义差异狋检验（Least significant difference-t,LSD-t）进行均数间的多重比较，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 藏红花素对HeLa细胞增殖的抑制作用
在0.4 mmol/L 的浓度下，藏红花素处理组与对照组细胞相比呈现下降趋势（P<0.05），且其抑制作用表现为浓度依赖性（图1）。各组HeLa细胞生存率间差异有统计学意义，P<0.05。
图1 藏红花素对HeLa细胞生存率的影响 ※vs空白对照组，P<0.05；※※vs空白对照组，P<0.01
2.2 藏红花素对HeLa细胞凋亡的诱导作用
用藏红花素处理过的HeLa细胞收缩，细胞质减少，胞质出现空泡状区域，并出现核固缩（图2）。流式细胞仪检测证实，藏红花具有诱导HeLa细胞凋亡的作用（图3）。阴性对照组凋亡率为3.64%，10μg/L秋水仙素阳性对照组为15.99%，0.4mmol/L 藏红花素处理组为4.86%，0.8 mmol/L 藏红花素处理组为9.28%。结果表明，藏红花素具有诱导HeLa细胞凋亡的作用。
2.3 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3激活的促进作用
0.4、0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa细胞24h后，蛋白质印迹法检测Caspase-3切割条带的变化，藏红花素能促进HeLa 细胞Caspase-3 蛋白的切割（图4）。提示藏红花素诱导HeLa 细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。
图2 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡（×400） A：正常HeLa细胞；B：藏红花素处理的HeLa细胞；C：秋水仙素处理的HeLa细胞
图3 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡 1：空白对照；2：0.4mmol/L藏红花素处理组；3：0.8mmol/L 藏红花素处理组；4：10μg/L秋水仙素阳性对照组
图4 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3的激活作用 1：对照；2：0.4mmol/L藏红花素作用HeLa细胞24h后，Caspase-3切割条带的变化；3：0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa 细胞24 h后，Caspase-3切割条带的变化
3 讨论
藏红花广泛分布于伊朗、西班牙、法国以及希腊等地，印度、日本也有栽培，经印度传入我国西藏，因此称为藏红花。近年来，传统中药的多靶点作用机制、较少不良反应等优点表现出诱人的应用前景，筛选出高效低毒的抗肿瘤中药是研究热点之一。
藏红花的有效成分主要包括产生苦味的物质以及多种色素，而后者对藏红花的疗效有着更为重要的意义。藏红花素是藏红花最主要的一种色素，由藏红花酸（crocetin）糖基化形成，是极其少见的水溶性类胡萝卜素。其特殊的水溶性及其对癌细胞强有力的抑制作用，使其成为了藏红花色素中更有望应用于癌症治疗的成分。用藏红花素处理过的HeLa细胞收缩，细胞质减少，胞质出现空泡状区域，并出现核固缩，这些都是藏红花素引起HeLa细胞凋亡的形态学证据，与文献报道相符。本研究通过MTT法和PI/Annexin双染法等方法证实了这一凋亡作用的存在。然而藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的信号通路尚不明确。
研究证实，藏红花素对多种癌细胞均有明显抑制作用，且在与其他常用抗癌药物配合治疗过程中，可降低抗癌药顺铂等的毒副反应，改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明，其有多种可能的作用通路，其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。我们对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行了研究，并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。
Caspase-3是CPP32亚家族成员之一，是新近予以关注的Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡过程中起关键作用，被认为是整个凋亡级联反应的一个关键调节点。本研究证实，藏红花素能促进HeLa细胞Caspase-3蛋白的切割，提示藏红花素诱导HeLa细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。
本研究对藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的机制进行了初步研究，该途径上游通路还有待进一步研究。
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