藏红花愈伤组织诱导和褐化抑制

2009-12-21 编辑：藏红花

藏红花愈伤组织诱导和褐化抑制

袁丽红陆玉婷黄晶

南京工业大学学报（自然科学版）第31卷第6期 2009年11月

摘要：对藏红花的球茎、无菌芽和幼叶的愈伤组织诱导条件进行研究，同时探讨愈伤组织诱导过程中的褐化和污染问题。结果表明：与球茎相比，以无菌芽和幼叶为外植体，愈伤组织诱导率较高，诱导时间较短，但形成的愈伤组织易褐化。较大球茎（≥20g）也是藏红花愈伤组织诱导较好的外植体，愈伤组织诱导速度随球茎储藏时间的增加而升高。含有2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）的MS（Murashige and Skoog）培养基有利于球茎愈伤组织的诱导，30d愈伤组织诱导率可达70%以上。在愈伤组织诱导过程中，连续转接外植体至新鲜培养基可以有效降低褐化率，而在培养基中添加活性炭（AC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）不能有效抑制褐化。表面灭菌前采用流水冲洗过夜可有效减少球茎表面附生菌，明显降低污染率。

关键词：藏红花；球茎；愈伤组织；诱导；褐化

藏红花（Crocus sativus L. , C. sativus）又名番红花、西红花，鸢尾科草本植物，原产于欧洲地中海地区，其干燥柱头作为传统名贵药材，一直在临床上广泛使用。我国传统中医认为藏红花性味甘平，入心、肝经，能活血化瘀，散郁开结，主治忧思郁结、胸膈痞闷、吐血、伤寒发狂、惊悸恍惚、妇女闭经、产后瘀血腹痛和跌扑肿痛等。此外，藏红花作为一种珍贵调味剂、香料和染料在欧洲已经有几百年的悠久历史。现代医药学发现藏红花在抗肿瘤、免疫调节以及抗心血管系统疾病等方面具有良好功效，尤其是在抗肿瘤方面功效显著，藏红花柱头中藏红花素、藏红花苦素、藏红花酸等活性成分都具有良好的抗肿瘤作用，其毒副作用明显低于现常用抗肿瘤药物。因此，藏红花将成为抗肿瘤药物研究开发的新热点。

传统栽培条件下藏红花主要以球茎繁殖，但球茎繁殖系数低，退化现象严重，导致藏红花种源严重缺乏。藏红花的有效成分主要集中于柱头，由于藏红花资源有限，柱头产量也很低，其价格每kg高达2000美元左右，被誉为“植物黄金”。植物细胞工程的发展已经为很多植物的工业化生产提供了机会，同时也为解决藏红花资源短缺问题提供了一条有效途径。但离体条件下获得的花柱柱头状物再生时间长，诱导频率低，尤其柱头状物难以继代培养，并容易褐化和死亡，不利于大规模生产，因此筛选快速生长并能产生藏红花素、藏红花苦素和藏红花酸等药理活性物质的愈伤组织和细胞系，利用植物细胞培养技术大规模生产藏红花素等活性物质是解决藏红花资源的有效方法之一。陈书安等以藏红花芽、叶和花为外植体进行愈伤组织诱导和细胞系筛选工作，从229株细胞系中筛选出生长快、不易褐化细胞系Corm1，其藏红花素1的含量为1677mg/g。郭志刚等也筛选出生长较快的藏红花愈伤组织并通过二步培养法生物合成藏红花素。此外， Julio等还发现藏红花球茎诱导形成的愈伤组织能合成一种与球茎中相同的蛋白聚糖，可有效抑制人体癌细胞生长。

筛选获得生长能力强和代谢产物含量高的细胞系的关键是愈伤组织的诱导，但在此方面的研究报道较少。笔者以藏红花球茎、芽及幼叶为外植体，研究不同诱导条件对愈伤组织诱导和形成的愈伤组织特征的影响，为大量培养藏红花细胞的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

藏红花球茎采自上海崇明岛。球茎大小按质量分为10g以下、10～20g和20g以上3个等级。不同生理状态的球茎储藏时间分别为3、30、70、100和150d。

1.2 培养基

MS（Murashige and Skoog）培养基，附加30g/L蔗糖，pH5.8；B5培养基，附加20g/L蔗糖，pH5.5。附加生长调节剂分别为：1）2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2.0mg/L和6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.25mg/L；2）2,4-D 30mg/L和6-BA 0.25mg/L；3）2,4-D 2.0mg/L和6-糠基氨基嘌呤（KT）0.5mg/L；4）萘乙酸（NAA）2.0mg/L和KT 0.5mg/L；5）2,4-D 2.0mg/L和6-BA 0.1mg/L；6）2,4-D 2.0mg/L和6-BA 0.5mg/L；7）2,4-D 1.0mg/L和6-BA 0.5mg/L；8）2,4-D 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L。其中1）～3）用于无菌芽和幼叶，1）～8）用于球茎。

1.3 外植体表面灭菌与愈伤组织诱导

剥去藏红花球茎皮膜，将球茎洗净或再将洗净的球茎于流水下冲洗过夜，先用75%乙醇浸泡1min，再用0.1% HgCl₂溶液表面灭菌6～15min，无菌水漂洗4次，用灭菌滤纸吸干球茎表面水分后切成0.5～1cm的小块，接种于培养基中，于（21±0.5）℃下黑暗培养。

球茎表面灭菌后切下芽点，置于适宜的培养基上萌发形成无菌芽，以无菌芽直接作为诱导愈伤组织诱导材料，将无菌芽切成0.5～1cm的小段，接种于培养基上培养。

藏红花球茎置于光照培养箱内，每天光照10h，21℃下花芽萌发形成4～6cm幼叶作为外植体，灭菌方法同上。去掉花芽外表皮后，切成0.5～1cm的小段，接种于培养基上培养。

1.4 抗褐化试剂

1）活性炭（AC）1.0mg/L

2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）1.0mg/L

1.5 数据统计和分析

愈伤组织诱导率＝形成愈伤组织的块数/接种块数×100%

愈伤组织污染率＝污染块数/接种块数×100%

愈伤组织褐化率＝褐化的愈伤组织块数/接种块数×100%

对实验数据进行统计分析，分析时将百分数转换成反正弦值，实验均重复2次；p≤0.05，凡标相同字母的表示差异不显著（分别用a、b、c、d、e和f表示），标不同字母的表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 表面灭菌方法对外植体灭菌效果的影响

文献报道以球茎为外植体其表面灭菌方法是球茎洗净后于75%乙醇浸泡1min，再用0.1% HgCl₂溶液处理15min。但由于球茎生长于土中，其表面带有大量微生物，因此选择合适的表面灭菌方法对愈伤组织诱导极其重要。为了减少附生菌数量，提高消毒效果，本研究将球茎洗净后先在流水下冲洗过夜，然后再进行表面灭菌，该灭菌方式对球茎灭菌效果和愈伤组织诱导情况影响结果如表1所示。

表1 表面灭菌方法对藏红花外植体灭菌效果的影响

表1表明，采用文献报道的处理方法，愈伤组织诱导过程中外植体污染率高达288%，并且污染微生物主要生长于球茎表面，说明附生于球茎表面的微生物并未被完全杀死。而采用灭菌前先流水冲洗，外植体组织块污染率显著降低，只有56%，说明表面灭菌前用流水冲洗可明显减少球茎表面的附生菌，愈伤组织诱导率也有明显提高。进一步考察HgCl₂处理时间对灭菌效果及愈伤组织诱导率的影响，结果发现缩短灭菌时间，污染率明显升高，愈伤组织诱导率显著降低。可见，球茎有效的表面灭菌方法是先用流水冲洗过夜再用0.1% HgCl₂处理15min。

2.2 藏红花不同外植体愈伤组织诱导差异

以球茎、花芽中幼叶和无菌芽为外植体，分别接种于附加不同生长调节剂配比的MS培养基中，愈伤组织诱导情况如表2所示。

表2 藏红花不同外植体愈伤组织诱导的差异

藏红花不同外植体愈伤组织形成时间和诱导率不同。芽和幼叶较容易诱导出愈伤组织，接种11d左右，芽的周围可见明显的淡黄色或半透明愈伤组织，幼叶边缘向上卷曲，在切口周围有白色或半透明愈伤组织形成。而球茎愈伤组织发生时间较晚，20d左右时在鳞片表面、芽眼处和切口处方见白色或黄色愈伤组织形成。另外，愈伤组织诱导率与生长调节剂组合及浓度配比有关，芽和幼叶的诱导率较高，在2.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA生长调节剂组合中芽的诱导率最高可达72.1%，较高生长素浓度3.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA的生长调节剂组合对幼叶愈伤组织诱导效果最好，2.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA生长调节剂组合也适合诱导球茎愈伤组织。

不同外植体诱导形成的愈伤组织如图1所示，尽管芽和幼叶愈伤组织诱导率较高，但是愈伤组织性状不稳定，芽诱导出的愈伤组织刚开始生长旺盛，较柔软，呈半透明状，但在诱导培养过程中愈伤组织颜色逐渐加深为橙黄色，生长速度变慢，部分愈伤组织容易褐化。幼叶诱导产生的大部分愈伤组织较为坚硬，生长速度极为缓慢，容易褐化，部分愈伤组织膨大物形成棉花状愈伤组织，无法继续培养。球茎诱导的愈伤组织质地较芽和幼叶愈伤组织致密疏松，刚开始为乳白色或者浅黄色，在诱导培养过程中愈伤组织颜色逐渐加深呈淡黄色，部分颜色变为橙红色或红色，仍能保持良好的生长趋势。因此，诱导培养过程中，选择球茎为外植体可得到性状较好的愈伤组织。

图1 藏红花不同外植体诱导形成的愈伤组织

2.3 基本培养基对愈伤组织诱导的影响

将球茎外植体分别接种于附有不同浓度6-BA的MS和B5 2种培养基中，考察培养基类型对愈伤组织诱导效果的影响，结果如表3所示。由表3可知，不同基本培养基对藏红花球茎愈伤组织诱导效果存在显著差异且愈伤组织诱导率与生长调节剂组合也具有一定相关性。随着分裂素6-BA浓度的增加均有愈伤组织诱导率升高的趋势。相同生长调节剂水平下，MS更有利于愈伤组织的诱导，MS培养基中愈伤组织诱导率较高，愈伤组织长势良好，生长速度较快；而在B5培养基中形成的愈伤组织不仅诱导率低，生长速度慢而且容易褐化。这与培养基的营养成分有一定关系，MS培养基中无机养分的数量和比例均较合适，与B5培养基成分相比，MS培养基中的硝酸盐和铵的含量较高，更有利于藏红花球茎愈伤组织的诱导，故以MS为基本培养基。

表3 不同基本培养基对藏红花愈伤组织诱导的影响

2.4 不同生长调节剂组合及浓度配比对愈伤组织诱导的影响

从以上实验可以看出，生长调节剂对藏红花愈伤组织的诱导具有一定的影响。以藏红花球茎为外植体，进一步考察不同生长调节剂组合及浓度配比对愈伤组织发生时间及诱导率的影响，结果如表4所示。由表4可见，生长调节剂组合及浓度配比对愈伤组织的发生时间和诱导率都有明显影响，相同生长调节剂浓度条件下，2,4-D和6-BA组合最有利于球茎愈伤组织的诱导，NAA和KT、2,4-D和KT组合尽管能诱导出愈伤组织，但愈伤组织诱导率低，诱导培养过程中生长活性低，易褐化。进一步考察2,4-D与6-BA不同浓度配比对愈伤组织诱导的影响，发现2,4-D与6-BA不同浓度的配比对愈伤组织诱导有显著影响。2,4-D浓度不变时，愈伤组织诱导率随6-BA浓度减少逐渐下降；当6-BA浓度不变，过高或过低浓度的2,4-D都不利于球茎愈伤组织的诱导。因此，选择相对适合浓度的外源生长调节剂组合是诱导愈伤组织的关键。在本实验中2.0mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-BA组合愈伤组织诱导率最高，且愈伤组织生长速度较快，不易褐化。

表4 不同生长调节剂组合及浓度对藏红花愈伤组织诱导的影响

2.5 球茎大小和生理状态对愈伤组织诱导的影响

球茎作为藏红花的营养根，其大小与后期叶的生长和开花都有一定相关性，球茎越大，生长期发叶越多，开花率越高。本实验也考察了不同大小的球茎愈伤组织诱导的影响。将藏红花球茎按质量分为10g以下、10～20g和20g以上3个等级，结果见表5。由表5可知，随着球茎质量的增加，愈伤组织诱导率提高。这可能由于较大的球茎积累了较充足的养分，为愈伤组织诱导和生长提供足够营养，从而愈伤组织形成能力也较强。因此，较大球茎更适合作为诱导愈伤组织的材料。

表5 球茎大小对藏红花愈伤组织诱导的影响

不同生理状态的球茎其愈伤组织发生和诱导也具有一定的差异，结果见表6。由表6可知，随球茎储藏时间的延长，愈伤组织发生时间提前，诱导能力逐渐增强。储藏时间小于60d时球茎处于休眠期，此时其对外源的生长调节剂敏感性低，愈伤组织发生迟，生长速度慢，诱导过程较长。球茎储藏80d左右，花芽开始萌动，其内源激素开始变化，球茎对外源生长调节剂敏感性提高，对生长物质的吸收明显加速，所以愈伤组织发生早，生长速度快，短时间内就可以得到较高的诱导率。

表6 球茎生理状态对藏红花愈伤组织诱导的影响

2.6 褐化的减轻和控制

在以藏红花球茎为外植体诱导愈伤组织过程中，在切开的伤口处极易褐化，导致培养基颜色呈深红色，影响愈伤组织的形成，即使形成愈伤组织褐化较轻，但随着时间延长，愈伤组织也逐渐褐化，并可造成愈伤组织死亡。因此，在藏红花愈伤组织诱导中减轻和控制褐化是一项重要研究工作。文献报道了在培养基中添加吸附剂或连续转移易于褐变的外植体材料都能有效抑制褐变。在培养基中分别添加1g/L的AC和1g/L的PVP考察球茎愈伤组织诱导率及褐化率的差异（表7），结果发现球茎外植体严重褐化并死亡，愈伤组织诱导率为0。而采用连续转移外植体至新鲜培养基的方法，褐化程度明显减轻，愈伤组织诱导率也有所提高。这由于将外植体转移到新鲜的培养基上生长这段时间内，外植体伤口愈合，外渗停止，在一定程度上可以缓解褐化，因此连续转接可以作为球茎愈伤组织诱导控制褐化的有效方法。

表7 不同处理方法对藏红花球茎愈伤组织褐化的影响

3 结论

藏红花不同外植体愈伤组织形成时间和诱导率是不同的。以无菌芽和幼叶为外植体，诱导率较高，诱导时间较短，但形成的愈伤组织易褐化，而以球茎为外植体可得到性状较好的愈伤组织。含有2mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-BA的MS培养基有利于球茎愈伤组织的诱导，30d愈伤组织诱导率可达70%以上。同时，球茎由于大小及生理状态的不同，其愈伤组织发生与诱导都存在一定差异，较大（≥20g）或储藏时间较长的球茎愈伤组织形成时间较早，形成能力强。在愈伤组织诱导过程中采用连续转接外植体至新鲜培养基的方法可以有效降低褐化率，而在培养基中加入活性炭AC和聚乙烯吡咯烷酮PVP不能有效抑制褐化。此外，表面灭菌前采用流水冲洗过夜可有效减少球茎表面附生菌，明显降低污染率。

Callus induction and browning inhibition of Crocus sativus L.

YUAN Li-hong, LU Yu-ting, HUANG Jing

Abstract: Callus induction from corms, sterile buds and young leaves of Crocus sativus L. was studied, and the browning and contamination in the callus induction were also explored. Results indicated that with the sterile buds and young leaves as explants, the percentage of callus inducement was higher and the inducing time was shorter than that with corms as explants, but the browning took place easily in callus. The bigger corms (≥20g) were suitable for the callus induction. Moreover, the longer corms were stored, and the faster calli were induced. The percentage of callus inducement was over 70% within 30d by using Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 2.0mg/L 2,4-D and 0.5mg/L 6-BA. Inoculating explants to fresh media in succession could effectively reduce the browning, whereas media with the addition of activated carbon and polyvinylpyrrolidone were ineffective to diminish the browning. Washing corms with running tap water overnight before sterilization were effective for reducing surface epiphytic microorganisms significantly and depressing the rate of contamination.

Keywords: Crocus sativus L. ; corm ; callus ; induction ; browning