西红花苷-1对急性低氧条件下大鼠学习记忆及海马SIRT1表达的影响

2013-06-06 编辑：藏红花

西红花苷-1对急性低氧条件下大鼠学习记忆及海马SIRT1表达的影响
Effect of crocin-1 on learning, memory, and expression of SIRT1 in hippocampus of rats under acute hypoxia

本研究发表于中草药期刊2013年5月第44卷第10期，文章编号：0253-2670(2013)10-1314-04。DOI：10.7501/j.issn.0253-2670.2013.10.021。

作者和单位

张晓岩¹，喻静²，张先钧¹，贾炜¹，蒲小燕¹，梁宏¹
1.青海大学医学院基础医学部，青海西宁 810001
2.日本东京大学医学系研究科，日本东京 113-8655

中文摘要

目的研究西红花苷-1对急性低氧条件下大鼠学习记忆及海马区沉默信息调节因子1（SIRT1）表达的影响。方法 SD大鼠随即分为5组：对照组，低氧模型组，西红花苷-1低、中、高剂量（25、50、100 mg/kg）组。西红花苷-1各组每天im给药1次，给药3 d后低氧环境下刺激72 h，采用Morris水迷宫观察大鼠的学习记忆行为，免疫组化法与Western blotting法检测大鼠海马SIRT1蛋白表达。结果与低氧模型组相比，西红花苷-1各剂量使Morris水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期均明显缩短，且穿越平台次数增加（P＜0.05）。免疫组化和Western blotting法检测显示，西红花苷-1各组大鼠海马组织SIRT1蛋白表达均显著高于低氧模型组（P＜0.05），其中以中、高剂量组作用明显。结论西红花苷-1预先给药，可增加急性低氧大鼠海马组织SIRT1蛋白表达，这可能是其改善低氧条件下大鼠学习记忆的机制之一。

英文摘要

Objective To investigate the effect of crocin-1 on behavior of learning and memory in rats under acute hypoxia and on the expression of silent information regulator l (SIRT1) in hippocampus of rats. Methods SD rats were randomly divided into five groups: control, hypoxia model, low- , mid-, and high-dose (25, 50, and 100 mg/kg) crocin-1 groups. The SD rats in crocin-1 groups were im administered once daily for 3 d and then were stimulated for 72 h under hypoxia. Morris water maze was used to investigate the learning and memory behaviors. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect the SIRT1 expression. Results The escape latency in crocin-1 groups was shorter than that in hypoxia model group, while the frequency of bestriding platform was increased (P < 0.05). Immunohistochemical staining and Western blotting both showed that the expression level of SIRT1 was higher in crocin-1 groups than that in hypoxia model group (P < 0.05), and the expression levels in mid- and high-dose groups were obviously higher. Conclusion Crocin-1 could increase the expression of SIRT1 in hippocampus of rats, which maybe one of the important mechanisms for crocin-1 improving learning and memory function of SD rats under acute hypoxia.

针对高海拔低氧的特殊环境，机体的适应机制尤其是对缺血、缺氧敏感的脑海马组织的适应性对机体非常重要。西红花（又名藏红花）Crocus sativus L. 中主要有效成分西红花苷-1 具有预防动脉粥样硬化、防治心血管疾病、抗氧化、治疗脑梗塞和神经变性损坏等广泛的药理活性^[1-2]。沉默信息调节因子1（silent information regulator l，SIRT1）是NAD⁺依赖的蛋白去乙酰化酶，在胚胎脑组织中的表达水平特别高，在成年大鼠脑皮质、海马和小脑中也有表达，其调节细胞的许多功能，如基因修复、抗凋亡、抗应激、代谢等^[3]。因此通过调节SIRT1 的表达可以降低细胞损伤、抑制细胞凋亡、抗氧化。从天然药物和植物中开发SIRT1 激动剂是值得关注的课题。本实验将西红花苷-1 预先给予大鼠，观察其对低氧条件下大鼠学习和记忆能力的影响及对脑海马SIRT1 的调控作用。

1 材料

1.1 药品与试剂

西红花苷-1，成都普瑞科技有限公司，批号C110113，质量分数≥97%；兔抗大鼠SIRT1 一抗，Santa Cruz Biotechnology 公司；兔抗大鼠SIRT1 二抗、辣根过氧化物酶显色试剂盒（DAB），北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物

雄性SD 大鼠，清洁级，体质量200～230 g，购于青海省地方病防治研究所实验动物中心，合格证号：SCXK（青）2005-0001。

1.3 仪器

DMS-2 型Morris 水迷宫视频跟踪分析系统，中国医学科学院药物研究所；DYCZ-24DN 型双垂直电泳槽、DYCP-40E 型半干转移槽、DYY-7C 型电泳仪，北京市六一仪器厂；温控摇床，美国New Brunswich 公司；化学发光型Micro Chemi凝胶成像系统，以色列DNR 公司。日本Olympus BX51 显微镜。

2 方法

2.1 分组与给药

30 只SD 大鼠称质量，排序，采用随机数字表将大鼠随机分为5 组，每组6 只，分别为低海拔（2260m）对照组，低氧模型组（海拔4000m），西红花苷-1 低、中、高剂量（25、50、100 mg/kg）组。在低氧刺激前3d 开始给药（药物用量为人用药剂量的3 倍），每天im 给药1 次，连续给药3d，3d 后将大鼠运至青海省达日县（海拔4000m）进行低氧刺激。

2.2 Morris 水迷宫实验

大鼠于低氧刺激前3d 开始进行行为训练，每天上午训练3次，每次间隔30min。水迷宫为直径160cm、高80cm 的圆形水池，水深50cm，水温20～24 ℃，站台高25cm，直径8cm，置于某一象限内的固定位置，没入水下2cm，迷宫外参照物保持固定。

2.2.1 定位航行实验从站台所处象限外的其他3个象限中随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入池中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的潜伏期。若60s 内找不到站台，则将其放在站台上15s 后再放回笼中，潜伏期记为60s。训练时分别从3个不同的入水点入水。每天测试大鼠2次，每次间隔15min，连续训练3d，记录各组潜伏期。

2.2.2 空间探索实验将池中站台撤除，选定与站台区域相对的象限的中点为入水点，记录大鼠在2min 内在站台所在象限探索的时间以及穿越平台区的次数，以此评价大鼠的长时程空间记忆功能。

2.3 免疫组化法检测SIRT1 蛋白表达

Morris 水迷宫实验完成后，大鼠ip 10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉，断头处死，快速取脑海马组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，连续冠状切片（3μm），切片常规脱蜡，蒸馏水冲洗，PBS 冲洗5min，共3次，用枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行微波抗原修复，于新配制的0.3% H2O2 溶液中室温下孵育10min 以灭活内源性过氧化物酶；PBS 冲洗5min，共3次，分别滴加兔抗大鼠一抗（1∶100）50μL，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，应用SP免疫组化检测试剂盒进行免疫组化染色，DAB显色。免疫组化阳性反应细胞呈棕黄色，应用Leica QWinV3图像分析软件，每张切片取2个400倍视野，测定每个视野的阳性细胞数，计算细胞总数及灰度值、阳性细胞的平均灰度值。

2.4 Western blotting 法检测SIRT1 蛋白表达

提取大鼠脑海马组织蛋白，用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白的量。取30μL 蛋白样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转移1.5h至硝酸纤维素膜（NC）上，5%脱脂奶粉封闭2h后与1∶500稀释的兔抗大鼠SIRT1 一抗于4 ℃过夜，与1∶10000稀释的二抗室温孵育30min，再与化学发光剂（ECL）室温作用1min，曝光、显影和定影。胶片扫描后，采用Quantity One 软件对显影条带进行分析，以SIRT1 目的条带与β-actin 条带灰度的比值，作为SIRT1 蛋白的相对表达量。

2.5 统计学处理

运用SPSS11.5 进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

3 结果

3.1 对低氧刺激大鼠学习记忆的影响

定位航行实验显示，与对照组大鼠的寻台潜伏期（17.05±3.29）s 相比，模型组大鼠的寻台潜伏期为（45.38±9.52）s，显著延长（P＜0.05）。与模型组相比，西红花苷-1 低、中、高剂量组大鼠的寻台潜伏期显著缩短（P＜0.05），分别为（32.83±4.32）、（17.85±2.01）、（16.81±3.61）s。

空间探索实验显示，与对照组穿越平台的次数10.17±1.47 相比，模型组大鼠穿越平台次数明显减少（P＜0.05），为4.67±1.63。与模型组相比，西红花苷-1 低、中、高剂量组大鼠穿越平台的次数分别为7.50±1.22、10.33±1.37、11.17±2.40（P＜0.05），表明西红花苷-1 明显改善经低氧刺激的大鼠对平台位置的记忆能力。

3.2 对大鼠海马CA1 区SIRT1 表达的影响

免疫组化法染色后显微镜观察可见，对照组大鼠海马CA1 区神经细胞中SIRT1 蛋白相对特异地、均匀地表达，表达位于胞浆和胞核内，以胞浆为主，细胞呈棕黄色着色。部分胞核中因SIRT1 蛋白表达，DAB 初染，苏木素复染后，胞核并非呈蓝色，而呈较深的棕黄色。与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区SIRT1 表达明显下调（P＜0.05）。与模型组比较，西红花苷-1 各剂量组大鼠海马CA1 区SIRT1 表达不同程度地上调（P＜0.05)，以中、高剂量作用更为显著，而这两组间差异不显著。结果见图1、表1。

图1 各组大鼠海马CA1 区SIRT1 表达的免疫组化法检测结果

表1 西红花苷-1 对低氧大鼠SIRT1 蛋白相对表达量的影响

Western blotting 法检测显示，模型组大鼠海马CA1 区SIRT1 蛋白相对表达量低于对照组（P＜0.05）。与模型组相比，西红花苷-1 各组大鼠海马CA1 区SIRT1 表达均显著上调（P＜0.05)，以中、高剂量组作用更明显，但这两组间差异不显著。结果见图2、表1。

图2 各组大鼠海马CA1 区SIRT1 表达的Western blotting检测结果

4 讨论

在高海拔低氧环境中，机体神经系统形态结构及功能会发生很大变化，而对缺血、缺氧最为敏感的海马神经细胞则受到更大的影响。中枢神经系统的功能活动可通过学习记忆活动最直接表现出来，而脑海马组织是人学习和记忆的关键部位。有研究表明，西红花苷可提高慢性束缚应激模型大鼠的抗氧化酶活性，降低血浆中皮质酮水平，改善慢性应激诱导的学习与记忆损伤，减轻氧化应激对海马区的损伤；还可以改善脑缺血大鼠的空间学习及记忆功能^[4-5]。本实验发现，低氧条件在影响大鼠学习和记忆的同时抑制海马组织SIRT1 表达；西红花苷-1预先给药，明显缩短大鼠在Morris 水迷宫实验中潜伏期，增加穿越平台的次数，以中、高剂量组的作用尤为明显。表明西红花苷-1 对大鼠脑海马神经元功能具保护作用，从而显著改善低氧应激对海马组织学习记忆功能。

SIRT1 在抗氧化应激、细胞能量代谢、DNA 损伤修复、抑制细胞凋亡及保护神经细胞等方面发挥重要调控作用^[6-9]。本实验发现，西红花苷-1 组大鼠脑海马组织中SIRT-1 表达比模型组显著增加，以中、高剂量的作用尤为明显，表明西红花苷-1 对低氧应激后大鼠脑海马组织中SIRT1 蛋白表达有上调作用。

白藜芦醇、漆树黄酮、紫铆因等天然产物均为SIRTl 激活剂，有较强的抗氧化、清除自由基作用，这些作用主要通过激活组蛋白去乙酰化酶的活性来发挥生物活性^[10]。西红花苷-1 对SIRT-1的表达的上调可能是其发挥在低氧应激下对大鼠神经保护作用的重要机制之一，但具体机制尚需进一步研究。

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